摘要

特應性皮炎以慢性炎癥、屏障功能障礙和瘙癢為特征，搔抓等外界刺激會加重上述癥狀。

2024年11月，九州大學醫(yī)學研究生院皮膚科的Takeshi Nakahara等研究團隊在《International Journal of Molecular Sciences》期刊上發(fā)表了題為“Extracellular ATP Contributes to Barrier Function and Inflammation in Atopic Dermatitis: Potential for Topical Treatment of Atopic Dermatitis by Targeting Extracellular ATP"的研究。該研究探討了細胞外三磷酸腺苷在特應性皮炎病理生理中的作用，并評估了ATP釋放抑制劑氯膦酸鹽對特應性皮炎的藥物潛力。

研究表明，細胞外ATP會降低角質形成細胞中絲聚合蛋白的表達，而絲聚合蛋白是維持皮膚屏障完整性的關鍵蛋白，因此細胞外ATP會損害皮膚屏障功能。此外，白細胞介素-4和機械刺激會觸發(fā)ATP釋放，進而促進免疫細胞產(chǎn)生細胞因子和趨化因子，加劇炎癥反應。氯膦酸鹽可通過抑制ATP釋放，恢復角質形成細胞中的絲聚合蛋白水平，減少樹突狀細胞產(chǎn)生胸腺活化調節(jié)趨化因子，并改善特應性皮炎小鼠模型的癥狀。這些發(fā)現(xiàn)表明，靶向細胞外ATP有望成為改善特應性皮炎皮膚屏障功能和減輕炎癥的新研究策略。未來研究應進一步探索靶向ATP在臨床場景中的長期療效與安全性。

研究材料與儀器

材料

細胞、ATP、IL-4、氯膦酸鹽、MC903、熒光素-熒光素酶試劑、TRIzol試劑、RNeasy Plus Micro Kit、PrimeScript RT 試劑試劑盒、TB Green Premix Ex Taq、鼠源CCL17/TARC ELISA試劑盒、中性福爾馬林、乙醇、Dulbecco氏磷酸鹽緩沖液

實驗動物：8周齡雌性C57BL/6小鼠

儀器

熒光素-熒光素酶檢測相關設備、DTX 800多模式檢測儀、CFX Connect實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)、數(shù)字卡尺、蘇木精-伊紅染色相關設備、ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀、GraphPad PRISM 5軟件。

 ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀

實驗過程

體外實驗

1. 細胞培養(yǎng)：正常人類表皮角質形成細胞在添加牛垂體提取物、重組人表皮生長因子等成分的KGM-Gold培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞融合度達70%–80%時傳代，取第三代細胞進行后續(xù)處理。分離C57BL/6小鼠骨髓細胞，在含粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第10天收集非貼壁細胞，通過CD11c免疫磁珠陽性分選獲得純度95%–97%的骨髓來源樹突狀細胞。

2. 體外角質形成細胞劃痕模型建立：將正常人類表皮角質形成細胞接種于6孔板，待細胞形成完整單層后，用1000μL移液槍頭劃痕，劃痕后孵育15分鐘用于檢測細胞外ATP，孵育24小時用于熒光定量PCR檢測。

3. 細胞外ATP濃度測量：收集細胞培養(yǎng)上清液，離心后取上清，加入熒光素-熒光素酶試劑，通過化學發(fā)光法檢測ATP濃度。

4. 熒光定量PCR檢測：提取細胞或小鼠耳部皮膚組織的總RNA，反轉錄合成cDNA，采用TB Green Premix Ex Taq進行實時熒光定量PCR，檢測絲聚合蛋白、TARC及各類細胞因子的mRNA表達水平。

5. 酶聯(lián)免疫吸附試驗：收集骨髓來源樹突狀細胞培養(yǎng)上清液，使用鼠源CCL17/TARC ELISA試劑盒檢測TARC蛋白含量。

體內(nèi)實驗

1. 塵螨抗原誘導的小鼠特應性皮炎模型建立：將小鼠分為對照組、特應性皮炎組、特應性皮炎+氯膦酸鹽組。特應性皮炎組和特應性皮炎+氯膦酸鹽組小鼠雙耳涂抹含MC903的乙醇溶液，5小時后特應性皮炎+氯膦酸鹽組涂抹氯膦酸鹽溶液，特應性皮炎組涂抹溶媒；對照組涂抹乙醇。連續(xù)5天上述處理后，兩組均每日涂抹對應試劑至第10天。

2. 小鼠耳部厚度測量：每日使用數(shù)字卡尺測量小鼠耳部厚度，記錄變化情況。

3. 組織學檢查：取小鼠耳部皮膚，用10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片，進行蘇木精-伊紅染色，觀察表皮厚度和真皮內(nèi)炎癥細胞浸潤情況，統(tǒng)計炎癥細胞數(shù)量和表皮厚度平均值。

4. 經(jīng)表皮失水量測量：使用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀，在標準溫濕度環(huán)境下測量小鼠皮膚病變部位的經(jīng)表皮失水量。

使用Vapo Scan儀器在第0、2、4、6天測量病灶處 TEWL

5. 統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，采用單因素方差分析結合Bonferroni多重比較檢驗分析組間差異，P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

結論

細胞外ATP會降低角質形成細胞中絲聚合蛋白的表達，損害皮膚屏障功能；IL-4和搔抓等機械刺激會促進角質形成細胞、樹突狀細胞釋放ATP，進而加劇特應性皮炎的炎癥反應。而氯膦酸鹽可通過抑制囊泡核苷酸轉運蛋白來阻斷ATP釋放，能夠恢復IL-4或搔抓導致的絲聚合蛋白表達下降，減少樹突狀細胞產(chǎn)生TARC。外用氯膦酸鹽可改善塵螨抗原誘導的特應性皮炎小鼠模型的耳部腫脹、紅斑、鱗屑等癥狀，降低表皮厚度和炎癥細胞浸潤程度，改善皮膚屏障功能。靶向細胞外ATP有望成為特應性皮炎研究新方向，既能改善慢性癥狀，也可能緩解由外界刺激引發(fā)的急性加重癥狀。